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涨姿势啦!感受态细胞转化效率高,原来都这样做啊!

涨姿势啦!感受态细胞转化效率高,原来都这样做啊!

发布时间:2019-11-21

    从事多年的研发实验,平时常常听到客户这样问,为什么我也是用的这个感受态细胞,但转化效率没那么高?今天远慕生物科研者为大家进行详细讲解,教你如何提高感受态细胞转化率。


感受态转化效率定义
转化效率定义为转化 1 μl 质粒至给定体积的感受态细胞中所能产生的菌落形成单位(cfu)的数量。但是,转化 1 μl 质粒是不常见的。

实际上,转化效率常以在适条件下转化 100 pg~1 ng 高纯度超螺旋质粒来计算。

计算转化效率(TE)的公式为:TE=菌落数/μg/稀释度。

转化效率计算可以用来做比较细胞或连接效率。下面列出了推荐转化方法和一些技巧以帮助获得实验结果。
 

推荐方案

一、转化方法
冰上解冻细胞;
细胞中加入 10 ng~100 ng 的质粒 DNA(1-5 μl),混匀,切忌涡旋;
置于冰上 30 分钟;
42 热激 60 秒或根据推荐条件进行热激;
置于冰上 5 分钟;
加入 900 μl 室温的 SOC;
37 震荡(250 rpm)培养 60 分钟;
混匀细胞,切忌涡旋,并用 SOC 做 10 倍梯度稀释;
每个稀释比例取 50~100 μl 稀释液涂布于预热的选择平板上,37(SHuffle 菌株 30)过夜培养或按推荐条件培养 。

二、5 分钟转化方法
(与上述方法相比只有 10% 的转化效率)
手握解冻细胞;
细胞加入 10 ng~100 ng 的质粒 DNA(1-5 μl),混匀,切忌涡旋;
置于冰上 2 分钟;
42 热激 30 秒或按推荐方案进行热激;
置于冰上 2 分钟;
加入 900 μl 室温的 SOC 或 LB。快速取 50~100 μl 涂布于选择平板上,37 过夜培养(SHuffle 菌株 30)。

注意:使用非氨苄青霉素时,需要 37 震荡培养



转化技巧

01、解冻
细胞在冰上解冻;
管中的后一点感受态融化后,立即加入 DNA;
可以手握解冻细胞,但是一旦温度高于 0 时,转化效率就会下降;
细胞与 DNA 冰浴;
冰浴 30 分钟。预计每缩短 10 分钟会降低转化效率2倍 。

02、热激
温度和时间取决于转化体积和适用的容器,一般为 42 孵育 60 秒。

03、生长
37 生长1 小时对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有效果。预计每缩短 15 分钟会有 2 倍的转化效率损失;
SOC 比 LB 培养基的转化效率高 2 倍;
震荡或旋转晃动试管可使转化效率提高 2 倍 。

04、涂平板
选择转化效率不受温度、湿度明显影响的平板;
温暖而干燥的平板利于涂布,并能快速长出菌落。

05、DNA
用于转化的 DNA 应纯化,并重悬于水中或TE缓冲液中;
直接从连接产物中取 10 μl 的 DNA 用于转化,仅有 2 倍效率损失;
为实现转化,可通过柱离心或酚抽提和乙醇沉淀的方法纯化 DNA;
适 DNA 用量比通常认为的要低,纯化超螺旋 pUC19 的用量在 100 pg~1 ng 之间时转化效率高。但是,随着 DNA 用量增加至 100 ng,单次转化反应中得到的总克隆数也会增多。


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