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远慕新闻:细胞冻存和复苏的基本原则

远慕新闻:细胞冻存和复苏的基本原则

发布时间:2020-03-24

相信做过长期细胞实验的各位都知道,冻存细胞很重要,就像知道未来星际旅行要躺到休眠舱里睡觉一样!但,你明白其中的道理吗?


细胞冻存的好处

■ 节省实验室空间、我们的时间和老师的经费。

■ 给失败的实验,多几次洗心革面的机会。

■ 确保重复实验的一致性。

■ 确保未来实验的连接性。

所以这看似小小的一步,其实非常重要啊!

细胞冻存的基本原理:

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与,而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃ 以下时会集体罢工,使代谢活动近乎停止,细胞因此进入睡美人状态,使细胞「不会老」,所以可以长期保存。冷冻凝固的过程中,水分会在 0℃~-20℃ 区间形成不同形状的结晶「下图 1」,因此在细胞冻存时「降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度」是影响冻存成功与否的重要关键。

 


▲图1:0℃~-20℃ (红色区),冰晶生成量最多。(Fesenmaier,2011)

■ 降温速度慢:冰晶由细胞外开始形成,造成胞外渗透压变小,细胞内水份移动至细胞外,造成细胞脱水皱缩。

■ 降温速度快:水分流动时间短,细胞内外渗透压改变程度小,但大量水分留在细内造成大量胞内冰晶形成,使胞器损坏。


这些影响都会让细胞损伤、细胞凋亡或坏死,也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因或蛋白质组分变异等现象。由此可知,最适合的冻存条件为「在增加细胞渗透压稳定性的溶液中,以慢到能减少胞内冰晶形成、但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞」「下图2」。
 

 

 

 


▲图2:降温速度对细胞造成的影响


 

最温柔的冻存液:

 

细胞冻存液体中的「抗冻剂」是维持细胞渗透压平衡的关键,常见的成分有 DMSO、甘油等。这些成分能在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,平衡细胞内外的渗透压,避免细胞过分脱水皱缩、也能同时减少细胞内冰晶的形成;但这类成分对细胞有一定的毒性,所以需要使用高浓度血清来保护细胞,使冻存成本升高。而目前市面上常见的无血清细胞冻存液,会是对细胞最温柔的替代选择。

刚刚好的冻存方法:

上课快迟到时,嫌公交车速度太慢;送暧昧对象回家时,嫌走路速度太快。到底怎样的降温速度对细胞最好? 经研究证实:最佳降温速度为 -1℃/分钟;以下介绍三种常见冻存方法:

■ 手动程序降温:最传统的降温法,将细胞依序放在 4℃(30 分钟)、-20℃(1 小时)、-80℃(过夜);操作过程耗时久,容易做到一半就忘记。

■ 程序冷冻仪:简单来说就是特殊设计冷库,内建程序能准确控温,使细胞以每分钟-1℃ 的速度降至-135℃。

■ 程序降温盒:一般最广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充二甲基甲醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃ 的速度降至-80℃。

快狠准地叫醒细胞:

将冻存在-196℃ 液态氮中的细胞冻存管快速移至已 37℃ 预热的水浴锅中(水面需低于管口,避免水分意外进入冻存管),使细胞冷冻悬液迅速融化;此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃ 这个结晶形成温度范围(图 1),使冻存时细胞外的冰晶迅速融化,避免冰晶进入细胞形成再结晶,对细胞造成二次伤害。细胞复苏速度太慢,就会像舰长一样「醒来却一身病」,电影全程出现不到半小时就下去领盒饭啦!