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酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法)操作方法

酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法)操作方法

发布时间:2020-05-20

酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法)

简介:酸性磷酸酶 (acid phosphatase , ACP) 分布极广泛,遍布各种组织,主要存在于细胞的溶酶体内,所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内,各种动物中的酸性磷酸酶各有不同,酸性磷酸酶的适宜pH为4.5~5.5。酸性磷酸酶是一个蛋白家族。

检测原理是以磷酸苯二钠作为底物,在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法,通过Folin-酚(又称福林酚)显色,于分光光度计680nm处检测吸光度,以酶促反应时间为横坐标以产物生成量为纵坐标绘制进程曲线。曲线的起始部分在某一段时间内呈直线。该试剂盒主要用于组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

组成:
试剂(A):Phenol(10mM)  1ml
试剂(B):样品稀释液    100ml
试剂(C):ACP assay buffer  15ml
试剂(D):ACP终止液   100ml
试剂(E):Folin-酚显色液  15ml
使用说明书  1份

自备材料:蒸馏水;离心管或试管;水浴锅;比色杯;分光光度计

操作步骤(仅供参考):
1、准备样品:
① 血浆、 血清和尿液样品: 血浆、 血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒,尿液通常也可以直接用于测定,-20℃冻存,用于酸性磷酸酯酶的检测。
②细胞或组织样品:取恰当细胞或组织裂解液,如果有必要需进行适当匀浆,离心取上清,-20℃冻存,用于酸性磷酸酯酶的检测。
③植物样品:取适量的植物组织加入少量生理盐水或PBS,充分捣碎或研磨,静置,用纱布或滤纸过滤,留取上请液并测量体积,-20℃冻存,用于酸性磷酸酯酶的检测。
④高活性样品:如果样品中含有较高活性的酸性磷酸酶,可以使用样品稀释液稀释10-20倍。

2、稀释标准品
加入物                1     2      3       4      5
phenol(10mM)(ul)  50   100    150     200     250
蒸馏水(ul)          450   400   350     300     250
phenol浓度(mM)      0.04   0.08   0.12   0.16   0.2

3、ACP加样:按照下表设置空白管、标准管、测定管、对照管(选做),溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的酸性磷酸酯酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置2平行管,求平均值。

4、ACP检测:分光光度计,空白管调零,比色杯光径1.0cm,检测680nm处吸光度。

计算:根据测得的各待测样品的吸光度,于标准曲线上查出相应的酚含量,乘以稀释倍数后,换算为”nmol/ml·min”的活性单位。组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%

注意事项:
1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂,同时需避免反复冻融。
2、建议每次测定时都做标准曲线,以使标准更准确,另外标准品需避免反复冻融。
3、如果没有分光光度计,也可以使用普通的酶标仪测定。
4、所测样本的值高于标准曲线的上限,应用ACP Assay buffer稀释样品后重新测定。
5、待测样品中酸性磷酸酶活性较低时,可适当延长孵育时间至30min。
6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:6个月有效期。